正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義：

磷酸戊糖途徑途徑中6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）和6PGDH依次催化NADPH合成，與能量的平衡、生長(zhǎng)速率和細(xì)胞活力等密切相關(guān)。此外，6PGDH逆境生理中具有重要作用。

測(cè)定原理：

6PGDH催化6-磷酸葡萄糖酸和NADP+生成NADPH，NADPH在340 nm有特征吸收峰，而NADP+沒有；通過測(cè)定340nm吸光度增加速率，計(jì)算6PGDH活性。

組成：

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、酶標(biāo)儀、96孔板和蒸餾水。

粗酶液提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為1000~5000：1的比例（建議2000萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm。

2將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移至試劑一中充分溶解；在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min以上；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3. 取96孔板，依次加入10μl樣本190μl試劑一，于340nm處測(cè)定3min內(nèi)吸光值變化，第10 s吸光值記為A1，第190s吸光值記為A2。△A=A2-A1

注意：空白管只需要做一次。

6-PGDH酶活性計(jì)算：

使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）6PGDH活力的計(jì)算:

單位的定義：每ml血清（漿）每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

6PGDH（nmol/min/ml）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=2143.6×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中6PGDH活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

6PGDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=2143.6×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

6PGDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=2143.6×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

6PGDH（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(2000×V樣÷V樣總) ÷T=1.072×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.05 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，3 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，2000萬。

注意事項(xiàng)：

1. 配制好的工作液4℃穩(wěn)定7天，請(qǐng)配制后盡快使用。

2. 血清的CK不穩(wěn)定，采集樣本后盡快測(cè)定，4℃避光保存可穩(wěn)定24h。

3. 樣品蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定，可選用BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

4. OD值大于0.5可用提取液適當(dāng)稀釋樣品，并在計(jì)算公式中相應(yīng)的改變稀釋倍數(shù)。