測定意義：

α-GAL (EC 3.2.1.22)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，能專一地催化α半乳糖苷鍵的水解，主要參與棉子糖、水蘇糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL對于植物種子的萌發(fā)至關(guān)重要，種子萌發(fā)初期，其催化產(chǎn)生的D-半乳糖通過糖酵解途徑迅速轉(zhuǎn)化和消耗，為種子的萌發(fā)提供最初的能量來源，后期則主要參與細胞壁儲藏多糖水解。

測定原理：

α-GAL分解對-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成對-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計算α-GAL活性。

組成：

自備儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入2.5ml蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

粗酶液提?。?/span>

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1ml提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至400nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定（在EP管或96孔板中依次加入下列試劑）：

迅速混勻，放入37℃保溫30min

充分混勻， 400nm處測定吸光值A，計算ΔA=A測定-A對照。每個測定管需設(shè)一個對照管。

α-GAL活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標(biāo)準條件下測定的回歸方程為y = 0.00585x -0.0027；x為標(biāo)準品濃度（nmol/ml），y為吸光值。

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

α-GAL活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

α-GAL活性(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

α-GAL活性(nmol/min/10⁴cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T

=0.08×(ΔA +0.0027)

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.07ml；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細胞或細菌總數(shù)，500萬；T：反應(yīng)時間，30min。

b.用96孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準條件下測定的回歸方程為y = 0.0039x -0.0027；x為標(biāo)準品濃度（nmol/ml），y為吸光值。

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

α-GAL活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T

=59.83×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

α-GAL活性(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=59.83×(ΔA+0.0027) ÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

α-GAL活性(nmol/min/10⁴cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V反總]÷(500×V樣÷V樣總)÷T

 =0.12×(ΔA +0.0027)

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.07ml；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.01ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細胞或細菌總數(shù)，500萬；T：反應(yīng)時間，30min。