測(cè)定意義：

甜菜堿是一種廣泛分布于動(dòng)植物及微生物體內(nèi)的季銨型水溶性生物堿，是生物體內(nèi)膽堿的氧化產(chǎn)物，可以增強(qiáng)免疫力、降血脂、抗氧化、抗腫瘤，并可作為甲基供體，參與促進(jìn)動(dòng)物蛋白質(zhì)和脂肪代謝、增進(jìn)食欲、緩和應(yīng)激、調(diào)節(jié)滲透壓、穩(wěn)定維生素等多種生物作用，在化工、醫(yī)藥、食品添加劑等領(lǐng)域有較廣泛的應(yīng)用。

測(cè)定原理：

甜菜堿在強(qiáng)酸條件下和雷氏鹽發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，沉淀用丙酮溶解形成紅色溶液，在525nm處有特征吸收峰，測(cè)定525nm處的吸光值，可計(jì)算得樣品的甜菜堿含量。

試劑組成和配制：

試劑一：粉劑×3瓶，4℃保存；臨用前根據(jù)用量配制，每瓶加20ml蒸餾水溶解，加390μl濃鹽酸調(diào)pH為1。

試劑二：99%乙醚，自備。取無(wú)水乙醚59.4ml，加入蒸餾水0.6ml，混勻。

試劑三：70%丙酮，自備。（易揮發(fā)，根據(jù)用量自備，丙酮：蒸餾水=7:3）

自備儀器和用品：

天平、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、96孔板、乙醚、鹽酸、丙酮和蒸餾水。

甜菜堿提取：

取烘干后過(guò)40目篩的樣品約0.02g，加0.8ml水，置于60℃提取30min，期間不斷震蕩。再加入200μl提取液，混勻后10000g，25℃，離心10min，取上清液。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至525nm，蒸餾水調(diào)零。

2、操作表

充分混勻，4℃中反應(yīng)2h，12000rpm，25℃，離心10min，棄上清

混勻，12000rpm，25℃，離心10min，棄上清。置于通風(fēng)櫥使殘余乙醚自然揮發(fā)干凈

震蕩使沉淀充分溶解，取200μl于96孔板，記錄標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管525nm處吸光值A測(cè)定與A空白。ΔA=A測(cè)定管-A空白管。

注意事項(xiàng)：

1、試劑一配制時(shí)pH嚴(yán)格控制為1，否則會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)不完全，配制后4℃只能穩(wěn)定幾個(gè)小時(shí)，配制后盡快使用。

2、試劑二與試劑三對(duì)呼吸道有一定的刺激，請(qǐng)做好防護(hù)工作。

甜菜堿含量計(jì)算公式：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.502x + 0.0057，R² = 0.9993；x為甜菜堿濃度（mg/ml），y為吸光值。

甜菜堿含量（mg/g 干重）=（ΔA-0.0057）÷ 0.502× V標(biāo)準(zhǔn)÷(V樣÷V樣總×W) =1.99×（ΔA-0.0057）÷W

V標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)品體積，0.3ml；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.3ml；V樣總：加入提取液體積，1ml；W：樣本質(zhì)量，g