測定意義：

L-半乳糖途徑是合成AsA的主要途徑。Gal LDH位于線粒體內(nèi)膜，負(fù)責(zé)催化植物體內(nèi)AsA生物合成的最后一步，也是該途徑的關(guān)鍵酶之一，對植物體內(nèi)AsA含量的積累起著至關(guān)重要的作用。

測定原理：

Gal LDH催化L-半乳糖內(nèi)酯還原細(xì)胞色素c（Cyt c），還原型Cyt c在550nm有吸收峰；測定還原型Cyt c增加速率，來計算Gal LDH活性。

組成：

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入40ml蒸餾水，充分溶解。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入5ml蒸餾水，充分溶解。

自備儀器和用品：

臺式離心機、可見分光光度計、1ml玻璃比色皿、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml試劑一）進行冰浴勻漿。13000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

Gal LDH測定操作：

1. 分光光度計預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到550nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。

3. 依次在1ml玻璃比色皿中加入100μl上清液、800μl預(yù)熱的試劑二和100μl試劑三，迅速混勻后于550nm比色，記錄10s和130s的吸光值A1和A2，△A = A2﹣A1。

Gal LDH活性計算公式：

(1). 按蛋白濃度計算

Gal LDH活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原1nmol Cyt c 為1個酶活單位。

Gal LDH (nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹÷（Cpr×V樣）÷T

=289×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計算

Gal LDH活性單位定義：25℃中每克樣品每分鐘還原1nmol Cyt c 為1個酶活單位。

Gal LDH (nmol/min/g鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹÷（W×V樣÷V樣總）÷T

=289×△A ÷W

ε：還原型Cyt c摩爾消光系數(shù)，17.3×10³L/ mol/cm；d：比色皿光徑(cm)，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，1ml=0.001 L；10⁹：1mol=1×10⁹nmol；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100μl=0.1ml；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/ml，蛋白質(zhì)濃度需要另外測定，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量BCA試劑盒；V樣總：加入提取液體積，1ml；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，2min。

注意事項:

試劑二和試劑三配制好后3天內(nèi)使用完。