測(cè)定意義：

脫氫酶(dehydrogenase, DHA) 是一類催化物質(zhì)氧化還原反應(yīng)的酶，催化底物通過細(xì)胞色素系統(tǒng)被氧化，釋放的能量供機(jī)體使用，是生物體取得能量的一種方式。

測(cè)定原理：

在細(xì)胞呼吸過程中，氫受體2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC）在脫氫酶作用下接受氫以后，被還原為三苯基甲鐟（Triphenyl Formazone, TF），TF呈現(xiàn)紅色，在波長(zhǎng)485nm處有最大吸收峰，采用分光光度法于485nm測(cè)定其吸光值，即得脫氫酶活性。

試劑的組成和配制：

試劑一：粉劑×1瓶，使用前加10ml試劑二溶解，4℃避光保存（盡量現(xiàn)配現(xiàn)用）。

需自備儀器和用品：

篩子、天平、恒溫培養(yǎng)箱或水浴鍋、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、冰、蒸餾水、甲醇（不允許快遞，請(qǐng)用戶自備）。

樣品處理：

1、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1ml提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心20min。

3、液體：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

充分混勻，37℃培養(yǎng)24h

振蕩1h，8000g，25℃，離心5min，取1ml上清于比色皿，測(cè)定A485，△A=A測(cè)定-A空白管?？瞻坠苤灰鲆还?。

脫氫酶活力計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0422x - 0.0312；R2 = 0.9988；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/ml），y為吸光值。

1.按照蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：在37℃時(shí)，每mg蛋白樣品每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個(gè)酶活性單位。

DHA（μg/ min / mg prot）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反總÷（Cpr×V樣）÷T= 0.181×（△A+0.0312）÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：在37℃時(shí)，每克樣品每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個(gè)酶活性單位。

DHA（μg/ min /g 鮮重）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T= 0.181×（△A+0.0312）÷W

3. 按液體體積計(jì)算

酶活單位定義：在37℃時(shí)，每ml樣本每min催化產(chǎn)生1μgTF為一個(gè)酶活性單位。

DHA（μg/ min /ml）=（△A+0.0312）÷ 0.0422×V反總÷V樣÷T= 0.181×（△A+0.0312）

V反總：反應(yīng)總體積，1.65ml；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.15ml；T：培養(yǎng)時(shí)間，1d=1440min；W：樣品質(zhì)量，g； Cpr：蛋白濃度，mg/ml。

注意事項(xiàng)：

配制好的試劑一避光保存于4℃，最好在一周內(nèi)使用，若出現(xiàn)紅色，則不能使用。